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我校“生物无机化学”发展的三十年
发布时间:2014/5/27 10:24:07    作者:   来源:    点击率:
(文章来源:校史研究通讯 2014年第9期 作者:徐辉碧) “文革”后,1978年,国家百废待兴。在科学发展的信息方面,也与世界隔绝多年了。学校发动教师大兴调查研究,了解本学科国外在研究什么?徐辉碧是学无机化学的,她在北京图书馆的有关期刊上,第一次看到了“生物无机化学”,这深深地吸引了她的注意和兴趣。1979年,学校通知她去美国做访问学者,并要她提出具体研究方向。当朱九思找她个别谈话时,她明确回答去学习、研究“生物无机化学”。她告诉九思同志:“因自己没有学过生物化学,会遇到困难。有些同志劝我不要如此选择。但想到这个新兴交叉学科,国内几乎是空白,还是想迎着困难上。” 九思同志回答说:“就这么定了,不能改了,你会学好的。”1979年11月5日,徐辉碧和李再光、邹海明、徐则昆、叶能安五人,肩负着学校的重托,到了美国加州大学圣迭戈分校。 第一部分:1982—1984初期的工作 1982年初,生物无机科研组成立: 1981年11月徐辉碧从美国作为访问学者两年后回校,学校领导十分重视。1981年12月朱九思校长亲自主持专题汇报会,参加会议的有:科研处、人事处、图书馆---等部门的负责同志。徐辉碧汇报了在美国加州大学圣迭戈分校Dr. Schrauzer实验室从事生物无机化学研究两年的情况。她在国外期刊参与发表论文3篇,回国后打算从事生物微量元素硒的研究。朱九思同意成立生物无机化学科研组;人事处与化学系同意解决人员安排;科研处王家金处长立即表示提供5万元科研经费,解决两间实验用房;图书馆馆长表示增加订购10种有关中外文期刊。至此,我校生物无机化学科研组正式成立。 生物无机化学科研组第一个研究课题:硒酵母的制备及其功能研究。 根据美国Dr. Schrauzer研究硒酵母的一般原理(因保密,不了解具体情况)推测,我们制定了实验方案。参加人有徐辉碧、廖宝凉、周井炎、黄开勋、何佳文、阎铭榕等。白手起家建立了灭菌室,经过大家努力,不到一年,得到了硒酵母,其中硒化合物主要是硒代蛋氨酸。湖北医学院田鸿生教授实验室对硒酵母进行大鼠肺癌模型、可移植路易斯肺癌等作用的研究,结果表明:抑癌率到达40-50%。1983年9月,湖北省科委主持鉴定,结论:硒酵母在国内是首次研制成功,可制订临床试验标准,进行试验。后与哈尔滨大关节病研究所合作,初步完成了临床试验。硒酵母技术由该所转给了东北一制药厂。 “云南个旧锡矿工人肺癌早期预报”的研究 1983年,国家科委发布信息征求 “云南个旧锡矿工人肺癌早期预报和防治”项目的参加单位(要面试)。这个项目是周恩来总理生前亲自布置的。基于我们在“化学模式识别在生物微量元素谱研究中的应用”有一定的基础,于是,徐辉碧去参加了“云锡”的面试后,获准立项。由于项目涉及生物医学、分析化学、计算机模式识别等,我校参加人有化学系:徐辉碧、黄开勋、周井炎、范华汉、高秋华、何佳文、王万春、易紫兰、张罗平、钱晓良等及图像所李德华教授。我们与云锡研究所的同志,密切合作,获国家科委基金资助(国家自然科学基金的前身)。在三年期间(1983-1985),同志们奔波在武汉-云南个旧之间十几次,基本完成了这项艰巨的任务。1986年湖北省科委主持鉴定,结论:微量元素谱预报云南个旧锡矿工人肺癌有一定的应用价值。 1983年获批“无机化学”硕士点,研究方向是生物无机化学,还参与了学校获批的我国第一个“生物医学工程”博士点申报 1983年我们申报并获批了“无机化学”硕士点,重点研究方向是生物无机化学。队伍成员是无机化学教研室和分析化学教研室。 “无机化学”硕士点的建立为科研组的工作提供了很好的条件。1983年入学的第一个生物无机化学硕士研究生是张罗平。由于她的长期不懈努力,2012年她被聘请为美国加州伯克利大学(University of California, Berkeley)科研正教授。1983年我校由王君健教授牵头,康华光教授、徐辉碧教授组成三个研究方向,共同申报并获批了我国第一个“生物医学工程”博士点。1990年后,徐辉碧在在这个博士点招收研究生。 中国无机化学会决定:全国第一届生物无机化学会1984年在我校举行 1983年9月徐辉碧和廖宝凉参加了在安徽屯溪举行的全国第2届无机化学会。会上,王夔、倪嘉缵召集与会的生物无机化学代表首次讨论了如何发展我国生物无机化学的有关问题。后经商定,1984年11月在我校召开全国第一届生物无机化学会议。从此,我校与全国生物无机化学界紧密联系,学术带头人王夔、倪嘉缵院士三十年来一直关心、指导我们的工作。 长远研究方向的思考 在“硒与癌”关系的研究中,如何进行硒的生物效应机理的基础研究,探讨一个相对长远、稳定的研究方向是我们思考的重要问题。通过阅读了大量国内外有关文献,似乎有点眉目。临门一脚是在1983年,稽汝运院士推荐徐辉碧参加在上海举行的“国际化学致癌机理学术讨论会”得到的启示。会上,英国Willans教授 在报告中指出:“缺硒会导致活性氧自由基的增加,这如同癌症发生。” 中科院生物物理所忻文娟教授做了 “活性氧自由基与癌症关系”的报告。通过这次会,徐辉碧明确提出研究的切入点:硒与活性氧自由基(ROS)作用,并和科研组的同志取得了共识。于是,科研组初步确立了相对长远、稳定的研究方向:“重要疾病中硒与活性氧自由基(ROS)作用的基础研究”。 第二部分:1984—1993硒与活性氧自由基(ROS)作用的系统研究 硒与脂质过氧自由基(ROO˙)、超氧阴离子(O2ˉ˙)、羟基自由基(˙OH)、单线态氧(1O2)等的作用及其机理的研究 用电子自旋共振(ESR)证实了硒化合物是脂质过氧自由基的清除剂 文献告诉我们,硒化合物的抗氧化作用的机理之一可能是硒作为自由基的清除剂,但长期以来未被实验用ESR证实。第一个研究生张罗平的硕士论文就是针对这个问题而设计进行的。用卵磷脂作为生物膜的模型体系,在低温下经紫外线辐照可产生脂质过氧自由基(ROS之一)的ESR信号,其g值与峰形均与文献记载的脂质过氧自由基相同。加入硒化合物时,相同条件下产生脂质过氧自由基的ESR信号幅值明显衰减,且硒化合物的浓度越高,衰减越大。实验还表明:有机硒化合物清除自由基的能力大于无机硒化合物。对三个有机硒化合物二乙酸硒化物、二丙酸硒化物和二丙晴硒化物的清除自由基的能力比较的实验结果是:二丙酸硒化物>二丙晴硒化物>二乙酸硒化物。这与不同硒化合物电子供体能力及其对卵磷脂分子中不饱和脂肪酸链的亲和力有关。北京大学李崇熙教授和中科院上海冶金所刘征先参与了指导工作。 胡松洲用上述硒化合物对几种不饱和脂肪酸过氧自由基作用,观察到不饱和脂肪酸的不饱和度越大,硒化合物的保护作用越大。 综上所得结论是:通过实验首次用电子自旋共振(ESR)技术证实了硒化合物是脂质过氧自由基的清除剂。这个结果给我们以信心,使研究工作沿着这一思路往前走,探讨硒化合物与ROS各主要物种的作用。 系列二烷基二硒化合物与脂质过氧自由基、单线态氧的作用及Ebselen对羟基自由基(·OH)的作用 汪新文对合成的系列二烷基二硒化合物(R碳原子数n=2-6)研究了它们与ROS作用。ESR实验进一步证实所合成的硒化合物都能清除活性氧自由基。结果还表现出清除效果依R碳原子数为奇数或偶数而异的奇偶规律。当碳原子数为奇数时其清除效果明显大于偶数,这与Schwarz等在硒的生物效应研究中发现的奇偶规律相符合。吴叔鴒、邢军、伍跃辉用气相色谱法研究了上述二烷基二硒化合物对亚甲兰光敏化氧化二甲基呋喃反应的影响,观察到这些硒化合物是单线态氧的淬灭剂,测定了淬灭速度常数,探讨了淬灭作用的机理。鲍俊华、涂欢、杨祥良等用自旋捕获ESR技术证明,自旋捕获剂 DMPO和 PBN能捕获羟基自由基,所得到的ESR信号因体系中的硒化合物Ebselen及其衍生物的存在而衰减,表明这些硒化合物对羟基自由基(·OH)和超氧阴离子(O2ˉ˙)有清除作用。 真实生物膜的实验 范华汉用红细胞膜进行了相关研究。红细胞膜在低温下经紫外线辐照也可产生脂质过氧自由基的ESR信号。用有机硒化合物共同培养红细胞膜,对照组为不含硒的红细胞膜。结果表明有机硒化合物共同培养红细胞膜具有清除活性氧自由基的能力,不含硒的红细胞膜则无作用。 硒与脂质过氧自由基作用机理—硒中心自由基的产生 文献曾报道硒防辐射作用可能是其产生硒中心自由基。汪新文等推测硒与脂质过氧自由基的作用也可能与其产生硒中心自由基有关。通过质谱实验获得了硒化合物对脂质过氧自由基的清除是由于硒中心自由基所致的信息。实验观察到,在20eV(接近紫外线辐照能量)的电子轰击下RSeSeR,可分裂生成RSeSe˙碎片。这说明硒化合物分子中硒—碳键断裂,生成了硒中心自由基RSeSe˙。 量子化学计算结果支持硒中心自由基的生成,从理论化学的视角阐明了硒与脂质过氧自由基作用机理 孙杰根据重元素CNDO/2参量法对硒选择了有关参量,采用CH3Se·类型的硒中心自由基的构型优选值,通过自旋非限制性(UHF)的CNDO/2(s-pd-f)方法对二乙酸硒化物、二丙酸硒化物和二丙晴硒化物,进行了有关计算。结果表明,自由基中未成对电子主要定域于硒原子的Px轨道上。因此,无论从硒原子,特别是Px轨道的空间位置,或是从其上所携带的负电荷来看,都十分有利于它捕捉亲电的脂质过氧自由基。硒原子上所携带的净电荷的大小顺序是: 二丙酸硒化物﹥二丙晴硒化物﹥二乙酸硒化物。未成对电子轨道能级(HOMO)的高低顺序也是:二丙酸硒化物﹥二丙晴硒化物﹥二乙酸硒化物。而HOMO能级越高,就越有利于给出电子以破坏亲电的脂质过氧自由基。上述计算结果与这三个化合物清除脂质过氧自由基的ESR实验结果完全一致,这就支持了硒化合物通过硒中心自由基发挥清除作用的设想。 硒能催化产生(ROS)是硒的两面性的表现 程驿和冯志明对亚硒酸纳、还原性谷胱甘肽、过氧化氢体系进行了研究。用邻苯三酚自氧化法和电子自旋共振(ESR)技术均证实了:在此反应体系中通过亚硒酸钠的催化作用产生了超氧阴离子(O2ˉ˙)等ROS物种。说明在不同剂量条件下,一方面硒既能清除ROS,另一方面硒又能产生ROS。这表现出硒的生物效应的两面性。 硒的Weinberg剂量—效应曲线的微观机制 孙恩杰、杨祥良、邹娟、徐辉碧等,对国内外有关硒的生物效应、硒的剂量与ROS 关系,特别是对我们自己的比较长期研究工作,进行了系统的综合分析。提出了:“硒的生物效应—剂量关系的活性氧自由基机理。”硒对活性氧自由基的清除和产生均与体系中硒的剂量密切相关,同时又与活性氧自由基密切相关。比较低浓度的硒表现出对活性氧自由基的清除作用。比较高浓度的硒表现出对活性氧自由基产生的催化作用。硒的剂量、生物效应与活性氧自由基的三者关系体现了硒的Weinberg剂量—效应曲线的微观机制。后来,陈春英、程帮豪还在生物体系进行了三者关系的实验,证实了这一设想。Weinberg曲线通常研究的是剂量—效应关系,对硒而言,我们提出了剂量—效应—ROS三者的关系,它揭示了剂量—效应的微观机制。 第二部分研究工作的指导老师有:徐辉碧、廖宝凉、苏 嫦、周井炎和黄开勋。 第三部分:1993—2003硒与活性氧自由基(ROS)作用研究的深入:新技术应用 硒诱导细胞凋亡中的ROS调控信号转导机制 王海涛、杨祥良研究了“亚硒酸钠诱导SW480细胞凋亡过程中活性氧的作用”。用结肠癌SW480肿瘤细胞为模型,将亚硒酸钠与该细胞共同培养,研究亚硒酸钠对SW480细胞生长和凋亡的影响。结果发现亚硒酸钠,可抑制细胞生长,降低细胞的存活率,并诱导SW480细胞凋亡。在这个过程中ROS的含量显著增加,说明ROS在亚硒酸钠诱导SW480细胞凋亡过程中发挥着调控作用。至此,我们对硒与ROS的研究工作从对自由基清除进入与信号转导机制、离子通道等相关的研究新阶段。 硒通过离子通道拮抗活性氧ONOOˉ(过氧亚硝基阴离子)对神经细胞毒的保护作用 易永等合成了过氧亚硝基阴离子,用Fura-2显微荧光测定钙的技术发现,ONOOˉ作用于MN9D细胞,短时间内即可导致其细胞内游离钙离子浓度的剧烈升高。结果提示ONOOˉ的这种作用主要是通过激活L-型钙离子通道,使细胞外钙大量内流。Ebselen能有效拮抗ONOOˉ对钙离子浓度的影响,并存在一定的剂量效应关系。涂欢也观察到在单个神经细胞内羟基自由基(˙OH)对钙离子浓度的影响,及硒化合物的抑制作用,类似上述对于ONOOˉ的研究结果。 高中洪研究了黄芩黄酮的抗氧化及其对神经细胞氧化损伤的保护作用。 系统研究了四种主要的黄芩黄酮对羟基自由基(˙OH)、超氧阴离子(O2ˉ˙)等清除作用,探讨了黄芩黄酮清除ROS活性的构效关系。由于是首次报道 ROS对神经细胞 损伤时黄芩黄酮的保护作用,论文发表后引用率很高。 至此,我们从硒化合物对ROS的作用推广到具有抗氧化作用的中药与ROS体系的作用,说明了硒与活性氧自由基关系研究,原理上有一定的普遍性。 瞿祥虎等根据生物信息学原理,采用计算机程序对真核生物硒蛋白基因中SECIS 进行了比较和结构表征。 在43个 硒蛋白基因的3ˊ非翻译区(UTR)都能找到1-2个可能的 SECIS 茎-环结构。所有硒蛋白都具有的三段保守碱基是:AUGA-(A)AA-GA.而在一些随机挑选的非硒蛋白基因中均未找到典型的SECIS 茎-环结构。所得结果支持SECIS是真核生物硒蛋白基因的一个独有特征,且SECIS就位于3ˊ非翻译区(UTR)的观点。此方法对寻找具有重要生物功能的新的硒蛋白提供了一定的依据。 应用研究: (1)天天明滴眼液 我们与河南医科所韩秀娴大夫合作研究发现了微量元素、中药能阻止鸡眼轴长的增加,陆家政证明它们能清除眼晶体的ROS。在此基础上,设计了一种防治儿童近视的滴眼液。获临床批准后,此滴眼液转给武汉制药厂。1996年进入市场,名为:“天天明滴眼液。” 现改名为:“冰珍清目滴眼液”,由武汉远大天天明药业公司生产。我们以研究出这个药品而受到鼓舞。 (2)胰岛素口腔喷剂 为减轻糖尿病人每天打针的痛苦,我们决定研制一种非注射胰岛素,这是一个难度较大的自选项目,后获得国家的支持。参加这个项目的有田卫群、吴庆知、朱玉山、盛希群、陈泽宪等。1997-1999,在实验室研制成功并用透射电镜证实胰岛素通过了口腔粘膜。1999年12月通过国家评审的答辩,获得了临床批件,科研组出色地完成了临床前的研究任务。由于在选择转让公司上的失误,致使尚未获生产批件。 第三部分的主要的指导老师:徐辉碧、黄开勋、杨祥良、高秋华、刘琼、高中洪、杨继林和彭红等。 第四部分:2003—2013硒蛋白与疾病的关系的深入研究及铁的相关研究 1992年北京医科大学举行的全国“生物无机化学发展动向座谈会”的纪要中提到,我国的生物无机化学跃上了几个“台阶”。从研究小分子跨到研究生物大分子;从研究单一分子到研究分子系统;从研究化学反应系统到研究生物系统。这几个跨跃使我们从总体上有能力赶上世界研究的主流。我们的研究正是经过了这几个跨跃,使我们在“硒蛋白与疾病关系”研究方面,在世界上占有一席之地。在此期间获批了“生物无机化学与药物湖北省重点实验室”,于2004年12月建设立项,2008年通过验收。 1. 硒蛋白与疾病的关系 对硒蛋白与疾病关系的研究,主要围绕以下三个方面的内容展开: (1)硒与血管动脉粥样硬化 ① 硒对氧化型固醇导致血管损伤的抑制作用 对包括血管在内的21个大鼠组织摄入硒的分布进行了测定,结果显示缺硒鼠和足硒鼠蛋白硒的分布有明显差别,将二者的比值用Rf表示,发现大鼠眼Rf值最大,其次就是血管。说明眼和血管中的消耗更快,硒在眼和血管组织中发挥重要作用。进一步采用凝胶电泳和同位素标记技术发现硒在血管中以硒蛋白的形式存在发挥作用。在此基础上,揭示了硒对氧化型固醇导致血管损伤的抑制发挥重要作用。 ② 硒对血管抗氧化能力的影响 研究结果揭示,缺硒鼠血管GPx、TR的活性和总抗氧化能力明显下降,ROS的浓度和脂质过氧化产物MDA明显增加。如果缺硒鼠注入Triol上述变化更加显著,补硒可有效逆转这种变化。细胞做实验,得到类似的结果,并观察到剂量效应和时间效应。研究中还首次发现血管硒营养状态对血管TR的调控:长期缺硒引起大鼠血管组织TR的活性及mRNA表达增加。氧化型固醇注入血管会增加诱导型一氧化氮合成酶的活性,使体内NO的水平过量升高。NO与超氧阴离子结合,形成过氧亚硝酸根离子(ONOO-),可使蛋白质、核酸等生物大分子损伤,从而对血管造成损伤。补硒可以抑制这一现象。 ③ 硒对血液前列环素和血栓素浓度平衡的调节作用 研究结果表明硒缺乏会导致血液流动减慢,而氧化型固醇会使血液流动更慢,加之抗氧化能力下降,一些有害成分如活性氧与血管内皮的作用时间延长,从而使得内皮的损伤更大;硒可明显抑制Triol诱导血液前列环素和血栓素浓度比值的变化,使血液流动达到正常,加上抗氧化能力增加,从而减少了有害成分对内皮的损伤。这可能是血管硒蛋白预防动脉粥样硬化的重要机理之一。 ④ 硒对氧化型固醇诱导的平滑肌细胞凋亡的抑制 血管平滑肌细胞(VSMC)非正常凋亡是动脉粥样硬化发病机理的一个重要环节。对细胞进行吖啶橙染色后,荧光显微镜可见对照组细胞饱满,胞浆呈红色,核内均匀染呈绿色,凋亡细胞极少;而Triol作用24h后,细胞体积变小,细胞核染色质固缩,部分可见凋亡小体,且Triol浓度的增大,凋亡细胞增加。而经Na2SeO3和/或Vc预处理,凋亡细胞明显减少。流式细胞仪对凋亡细胞进行定量测定,结果显示VSMC经不同浓度的Triol处理24h,其凋亡率随Triol 浓度的增大而增加,呈现剂量的依赖性。经50nM Na2SeO3预处理VSMC 12h或24h,再用Triol处理24h。研究了硒抑制Triol 引起的细胞凋亡及机理。 ⑤ 硒与血管钙化 血管钙化是一种常见的病理生物矿化,指羟基磷灰石晶体在病变或损伤的大、中动脉组织的沉积,它是心血管疾病(如动脉粥样硬化、冠心病等)、糖尿病、慢性肾脏病及骨质疏松等多种疾病的病理特征和重要危险因素。氧化应激是血管钙化形成的主要诱导因素。基于血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨细胞分化是血管钙化形成的细胞基础,我们研究了硒对过氧化氢和超氧阴离子诱导的VSMCs向成骨细胞分化的影响及机制。结果显示,硒通过硒蛋白抗氧化、调节细胞氧化还原状态抑制了氧化应激激活的丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)信号途径和PI3K/Akt信号途径,同时抑制了氧化应激诱导的内质网应激凋亡途径,最终抑制了VSMCs向成骨细胞分化及钙化。该结果揭示了硒、氧化应激、血管钙化三者的关系,为硒预防动脉粥样氧化等心血管疾病提供了新的机理解释。 (2) 硒与糖尿病 硒与糖尿病的关系比较复杂,展现出两面性。早期研究表明硒具有类胰岛素作用,然而近来研究发现长期摄入超营养剂量硒具有促糖尿病作用,这一作用与几种硒蛋白密切相关,如GPx-1、SelS等。 我们着重以SelS和亚硒酸钠为对象,研究了SelS缺乏、亚硒酸钠对糖尿病发生发展的干预作用及其机制。 ① 硒对1型和2型糖尿病发生发展的干预作用 我们的结果表明,在四氧嘧啶或链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠中,灌胃给与亚硒酸钠2周可显著降低其血糖。补硒增加了胰腺组织中硒蛋白GPx-1和SelS的表达水平,抑制了小鼠胰腺和肝脏的氧化应激,并抑制促炎症细胞因子IL-1β、TNF-α 和IFN-γ的mRNA表达,改善了胰腺组织的免疫失衡,从而改善糖尿病病情。但在高脂饲料联合链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠中,灌胃给与亚硒酸钠4周对血糖无明显影响,而是显著地促进其胰岛素抵抗。进一步的研究表明,补硒4周促进了糖尿病小鼠肝脏组织中的氧化应激,激活了ROS-JNK信号通路,从而抑制胰岛素信号转导,使胰岛素敏感性进一步受损。 ② 长期高硒摄入对胰岛素敏感性的损伤作用及其机制 我们的结果表明,与缺硒组和足硒组小鼠相比,高硒组(喂食2.0 mg Se/kg饲料3个月)血浆胰岛素水平和胰岛素抵抗指数显著升高,葡萄糖耐量和胰岛素耐量受损。而且,高硒组小鼠肝脏和骨骼肌组织中IR、IRS-1及Akt磷酸化水平显著下降,出现胰岛素信号转导障碍。上述结果与国际同行的最新研究结果一致,均表明长期高硒摄入可诱导正常小鼠产生胰岛素抵抗和2型糖尿病症状,而本课题组首次证实了肝脏和骨骼肌中胰岛素信号转导受阻介导了高硒摄入的促糖尿病作用,为阐明这一作用的分子机制提供了新的实验依据。 ③ SelS对肝细胞中内质网应激、炎症、氧化应激与胰岛素抵抗的抑制作用 我们的结果表明,葡萄糖胺处理导致HepG2细胞中SelS表达和内质网应激水平升高,胰岛素信号分子的磷酸化水平下降。采用siRNA技术使细胞中SelS基因沉默后,葡萄糖胺诱导的内质网应激水平进一步升高,胰岛素信号分子的磷酸化水平进一步下降,表明SelS基因沉默加剧了葡萄糖胺诱导的内质网应激和胰岛素抵抗。上述结果提示SelS具有抗氧化功能,并对肝细胞中内质网应激、炎症反应与胰岛素抵抗具有抑制作用,研究结果为理解SelS的生物学功能及其与糖尿病的关系提供了新的实验依据。 ④ SelK在内质网应激中的调节作用 SelK和SelS在蛋白质一级结构上具有类似性,已知SelS是一个内质网应激调节蛋白,但未见到SelK在内质网应激条件下的作用。为此,我们采用SelK小分子RNA干扰等技术研究了内质网应激试剂β-ME和Tm对SelK表达的影响和SelK对于内质网应激导致的HepG2细胞损伤的保护作用。结果表明,10 mM β-ME和10 μg/mL Tm可分别显著增加HepG2细胞中SelK mRNA和蛋白质表达至200%、240%和250%、240%。RNA干扰抑制SelK mRNA和蛋白质表达可明显促进内质网应激诱导的HepG2细胞凋亡。这些结果第一次揭示了SelK是一个内质网应激调节蛋白,并且在保护细胞抵抗内质网应激诱导的细胞凋亡方面发挥重要作用。 ⑤ SelS对脂肪细胞中内质网应激与胰岛素抵抗的抑制作用 我们的结果表明,软脂酸钠处理导致3T3-L1脂肪细胞产生内质网应激与胰岛素抵抗,当SelS基因沉默后,此作用进一步加剧。这提示SelS对脂肪细胞中内质网应激与胰岛素抵抗具有抑制作用,这种作用可能与SelS作为ERAD逆向转运通道中的重要组成部分密切相关。研究还发现,在内质网应激反应信号通路中IRE-1α / JNK信号通路是介导上述效应的主要信号通路。 ⑥ ONOO-对骨骼肌细胞中胰岛素信号分子基因表达的影响 一定浓度的ONOOˉ处理骨骼肌细胞,显著减少了IR、IRS-1、CAP、Cbl和Glut4的基因表达水平,并具有浓度依赖性。而且,ONOOˉ在低浓度下促进HepG2细胞膜蛋白和胞质蛋白的酪氨酸磷酸化,可能起到信号分子的作用;在高浓度下抑制膜蛋白和胞质蛋白的磷酸化,可能与胰岛素抵抗的发生有关。进一步发现无论在基础状态下还是在胰岛素刺激状态下,低浓度的ONOOˉ促进了胰岛素受体的自磷酸化和激酶活性,可能作为一个信号分子,而高浓度的ONOOˉ抑制了胰岛素受体的自磷酸化和激酶活性,可能介导胰岛素抵抗的发生。ONOOˉ的这种双向调节作用可能与它对胰岛素受体的硝化和氧化修饰有关。 (3) 硒与白内障 糖尿病性白内障是糖尿病患者中最常见的慢性并发症之一,开展糖尿病性白内障发病机制的研究,具有重要的科学意义和应用价值。 我们以硒性白内障和糖尿病性白内障为对象,研究了硒致白内障和硒蛋白R在晶状体上皮细胞中的作用。 ① 亚硒酸钠致白内障发病机制的研究 硒性白内障作为一种实验性动物模型,用以模拟人类的老年性白内障。但是硒性白内障的产生必须在大鼠开眼之前注射亚硒酸钠,开眼之后即使加大亚硒酸钠的剂量,也无法造模成功,这种年龄上的特异性至今原因不明。为此,以硒性白内障模型动物为对象,采用氢氧化镧示踪法检测了不同年龄段血-视网膜屏障的发育情况,结果表明未开眼Wistar鼠的抗氧化能力不是其易于形成白内障的主要原因,而真正原因是由于未开眼幼鼠血-视网膜屏障发育不成熟,使得大量的亚硒酸钠进入眼中,导致晶状体氧化损伤而出现白内障。 为探讨亚硒酸钠诱发幼鼠白内障形成的机理,我们研究了硒诱导hLE细胞SRA01/04凋亡及其途径。结果说明,较高剂量的亚硒酸钠可明显诱发的hLE细胞凋亡,其途径主要是通过诱发产生的活性氧介导的线粒体途径,这与我们早期的研究结果是一致的。 ② 硒蛋白R(蛋氨酸亚砜还原酶)对晶状体氧化应激的调节作用 首先,我们以链脲佐菌素(STZ)诱发的糖尿病小鼠的晶状体为研究对象,比较了糖尿病早期小鼠和正常鼠晶状体的变化。发现部分小分子量的晶状体蛋白质含量明显下降,而55kDa 左右的蛋白含量有升高趋势;而MsrB1的mRNA和蛋白质表达水平显著下降;总蛋白中MetO、MDA、蛋白羰基水平均显著升高,晶状体组织中总巯基(TSH)含量显著降低,表明糖尿病小鼠晶状体受到氧化损伤,生物大分子发生氧化修饰,这与糖尿病小鼠晶状体Msrs表达受到抑制、抗氧化能力下降,对Met 损伤的修复功能受到影响的结果相一致。 进一步以hLE细胞为对象,发现高糖和MsrB1基因沉默均降低了hLE细胞存活率;高糖使MsrB1的mRNA和蛋白的表达降低,高糖与MsrB1 基因沉默共同作用引起胞内ROS和MDA水平的显著升高,hLE细胞凋亡率显著增加;而且线粒体膜压的下降,细胞色素c 向胞质释放加剧,caspase-3 酶活显著升高。表明高糖和MsrB1 基因沉默引起了细胞凋亡,且凋亡过程可能是通过胞内ROS 对线粒体的损伤所介导,可见MsrB1 对晶状体上皮细胞氧化还原平衡有重要的调节作用。 ③ MsrB1(SelR)对过氧亚硝酸根诱发人晶状体上皮细胞损伤的保护作用 基于过氧亚硝酸根(ONOO?)在糖尿病患者血管等组织中的存在,首先我们研究了MsrB1对ONOO? 诱导hLE细胞凋亡的抑制作用。结果表明低浓度的ONOO? 可以刺激hLE细胞增殖,而高浓度的ONOO? 明显导致hLE细胞死亡的增加。单独的ONOO? 处理或MsrB1基因沉默都可以诱导hLE细胞中氧化应激和内质网应激的发生,激活caspase-3,从而导致细胞凋亡。当MsrB1基因沉默细胞经300 μM ONOO? 处理后,使这一现象进一步加剧。说明MsrB1在抑制ONOO? 导致的氧化应激,调节细胞内的氧化还原平衡和缓解内质网应激中起着重要的作用,且MsrB1也可以通过抑制caspase-3的激活和DNA的氧化损伤保护hLE细胞抵抗由ONOO? 诱导的细胞凋亡的发生。 进一步我们研究了MsrB1对ONOO? 诱导hLE细胞骨架F-actin损伤的保护作用。结果表明低浓度的ONOO? 可以促进F-actin的组装,而高浓度的ONOO? 会损害F-actin的组装,与此同时,伴随着ERK1/2激活和ERK1/2抑制。高浓度的ONOO? 作用于MsrB1基因沉默的细胞加剧了细胞中F-actin的去组装和ERK的失活,进一步的研究显示F-actin的去组装伴随着F-actin蛋白硝化水平的增加,bFGF是通过MEK依赖性途径激活ERK1/2的磷酸化,而ONOO? 是通过MEK非依赖性途径激活的ERK1/2磷酸化。 硒蛋白与疾病关系的研究先后在Free Radical Biology and Medicine、 Biochemical and Biophysical Research Communications、Biochimica et Biophysica Acta、Archives of Biochemistry and Biophysics、Journal of Inorganic Biochemistry、Journal of Biological Inorganic Chemistry、Experimental Eye Research、Toxicology Letters、Toxicology and Applied Pharmacology、Journal of Nutritional Biochemistry、Life Sciences、Analytical and Bioanalytical Chemistry、Chemico-Biological Interactions、Molecular and Cellular Biochemistry、Biological Trace Element Research等期刊上发表,在国际上产生了一定的影响,黄开勋应邀于2010年五月底在日本京都市京都大学举行的“第九届硒的生物医学国际会议”作了“硒蛋白S与糖尿病”的大会邀请报告,并受邀成为10th International Symposium on Selenium in Biology and Medicine’(国际硒的生物医学研讨会)International Scientific and Program Organizing Committee成员。2013年与康奈尔大学Xingen Lei教授合作在Free Radical Biology and Medicine上发表了以周军为第一作者的特邀综述论文1篇(Selenium and Diabetes——Evidence from animal studies. Free Radical Biology and Medicine 2013, 65: 1548-1556),在这篇论文中,结合本课题组的工作系统介绍了该研究领域的最新进展,被Free Radical Biology and Medicine选为亮点论文(Highlighted Article)。期刊编辑部在论文发表同期配发了专题述评,并对该论文给予高度评价:“全面概括了对于硒与2型糖尿病之间意外联系的最新认识”;“将为最终理解这一意外现象并在人类营养与健康中合理使用硒铺平道路”。 在硒蛋白与疾病关系的研究中,参与研究的研究生包括:瞿祥虎、吴庆知、汤蓉、池泉、刘红梅、周军、张愚、曾金红、杜少卿、李轶、贾义、陈宏杰等。 指导教师:黄开勋、刘红梅、周军、徐辉碧 2.铁对机体中蛋白质酪氨酸硝化的促进作用及机理和聚合物磁性硅的研究 (1)研究了血红素催化NO2--H2O2体系硝化蛋白质酪氨酸残基的条件和影响因素 发现血红素催化NO2--H2O2体系硝化蛋白的效率与其过氧化物酶活性密切相关。血红素可与某些特定结构的多肽或蛋白结合,形成相应的复合物。当血红素与Ab结合时,过氧化物酶活性增高,且催化蛋白质酪氨酸残基硝化的能力也增强,该作用可能与阿尔兹海默病患者脑中蛋白质酪氨酸硝化水平上升有关。通过对血红素- Ab复合物催化NO2--H2O2体系硝化蛋白质的实验发现,血红素-Ab复合物催化的蛋白质酪氨酸硝化位点与游离血红素催化的结果不同,游离血红素催化硝化的位点处于蛋白的疏水区域,而血红素- Ab复合物催化的硝化位点更倾向于疏水区域。 (2)在一些动物模型上研究了疾病与蛋白质酪氨酸硝化的关系 在铁过载大鼠模型中发现,大鼠的肝脏中蛋白质酪氨酸硝化水平显著高于正常组,其中谷氨酸脱氢酶和谷胱甘肽硫转移酶都是可被硝化的蛋白;在糖尿病大鼠模型中,通过免疫沉淀的方法,确证了糖尿病组织和血清中α-烯醇酶是一种易于发生酪氨酸硝化的蛋白质。与正常大鼠相比,糖尿病心肌、肝脏和血清中α-烯醇酶的表达和硝化水平显著上升,经液-质联用技术鉴定了糖尿病大鼠心肌中α-烯醇酶的硝化位点在Tyr257 和Tyr131;在铁过载糖尿病大鼠模型中,发现铁过载促进了糖尿病大鼠肝脏葡萄糖激酶硝化位点的增加(糖尿病:Tyr-413,Tyr-289;铁过载糖尿病:Tyr-413,Tyr-289和Tyr-61)。并发现随着硝化位点的增加,GK的硝化程度随之加强,与疾病严重程度正相关。 (3)铁络合剂或抗氧化剂对血红素-NO2--H2O2体系导致的蛋白质酪氨酸硝化和氧化的影响 在体外化学体系中研究了一些铁络合剂或抗氧化剂对血红素-NO2--H2O2体系导致的蛋白质酪氨酸硝化和蛋白质氧化的影响,发现大多数抗氧化物可以有效抑制该体系导致的蛋白质酪氨酸硝化,但对蛋白质氧化的作用抑制效果较差。铁络合剂去铁敏(DFO)在低浓度时,可促进蛋白质氧化,其促氧化作用的机理是促进了O2?- 的生成。铁过载大鼠模型中发现,补充黄芩苷可降低铁过载导致的肝损伤,同时也可有效降低铁过载引起的肝脏蛋白质酪氨酸硝化。 (4)聚合物磁性硅的研究 合成并表征了以下几种新型的磁性吸附剂如:巯基修饰的磁性硅球,GMA-IDA接枝的聚合物磁性硅球(简称GMA-IDA/SiO2/Fe3O4),EDTA修饰的壳聚糖磁性硅球(简称EDTA/chitosan/SiO2/Fe3O4),及LBL法制备的壳聚糖/聚丙烯酸接枝的磁性吸附剂(简称Na-(chitosan/PAA)n/MPC),并应用于水溶液中重金属及阳离子染料的去除,同时还用于多种中药提取液如当归药液,黄芪药液及二者的复方药液中的重金属的去除,结果表明EDTA/chitosan/SiO2/Fe3O4 能显著去除中药中超标的多种重金属如铜、镉及铅等。特别是对当归药液中的重金属,不仅使其含量降低至国家限量标准以下,而且在去除重金属前后,当归药液中的主要药效学成分如阿魏酸的含量,药液的HPLC指纹谱图等都没有发生显著的变化,这些结果发表在“中国中药杂志”上,说明EDTA/chitosan/SiO2/Fe3O4 是一种在中药重金属去除方面,有潜在应用价值的磁性吸附剂,同时相关工作还发表在国际期刊如Chemical Engineering Journal, Separation Science and Technology, Journal of Wuhan University of Technology – Materials Science 等SCI 收录的杂志上。 参与这部分研究的主要研究生包括:赵玉玲、张燕、卢乃浩、袁灿、李雪犁、黄以、洪帆、王世珍等。 主要指导老师:高中洪、李海玲、彭红、黄开勋 平台建设: 生物无机化学与药物湖北省重点实验室是在华中科技大学“生物无机化学与药物研究室”的基础上,整合华中科技大学化学与化工学院生物无机化学、化学生物学和生命科学与技术学院纳米药物研究的力量,于2004年12月建设立项,2008年通过验收。 第五部分:2003—2013纳米药物的研究 1999年在北京举行的生物无机化学战略研讨会上,王夔先生提出了研究无机化合物的生物尺寸效应问题。当时,邓英正在研究雄黄诱导ECV-304凋亡。为此,在谢长生教授实验室制备了不同粒径的雄黄进行研究,观察到了尺寸效应。基于这一点,杨祥良和徐辉碧比较早地提出进行 “纳米药物”研究,同时得到领导大力支持。由于化学楼实验室面积难于满足一个新方向发展的需要,经校领导批准,纳米药物科研组迁至东11楼,参加到生命科学与技术学院的行列。纳米药物研究组产生于化学系的生物无机科研组,成长在生命科学与技术学院。在发展中,得到学院领导特别是党总支书记耿建萍同志的关心和支持。经过十几年的努力,集全校的力量,于 2009年,国家科技部批准我校建立国家纳米药物工程技术研究中心(筹),于2012年通过了验收。 从一个新的思路,发展到建立国家级的研究平台,令人深思。在这里,我们介绍的是纳米药物研究所的一部分与生物无机化学有关的工作。 生物无机化学中的纳米技术 纳米科技的快速发展,深刻影响并促进许多学科和技术的发展,对生物无机化学也不例外。近年来,许多无机纳米材料,如:碳纳米材料(石墨烯、碳纳米管)、磁性纳米材料(四氧化三铁、三氧化二铁、铁铂合金)、纳米二氧化钛、硅纳米材料(二氧化硅、多孔单晶硅)、量子点(硒化镉、碲化镉)等在纳米药物和纳米载药系统、医学影像对比剂,包括它们的生物安全性和纳米毒理学研究,极大地拓展了生物无机化学研究领域,促进了生物无机化学学科的发展。 近十五年来,在学术带头人杨祥良教授指导并参与下,在纳米生物无机化学研究领域也开展了相关研究,包括: (1)多功能纳米磁球用于脑胶质瘤的靶向磁共振成像; (2)纳米二氧化钛透皮行为与毒性机理; (3)三维石墨烯与细胞生物学效应; (4)量子点在纳米药物动力学研究中的应用 (1)多功能纳米磁球用于脑胶质瘤的靶向磁共振成像(Lf-SPIONs) 浸润性神经胶质瘤(脑胶质瘤)是成年人最常见的原发性脑肿瘤。谢辉、朱艳红等发现 C6 脑胶质瘤上乳铁蛋白 (Lf) 受体表达高于癌旁组织与正常脑组织 (p<0.05)。将 Lf 与纳米磁球偶联制备了一种新型肿瘤靶向纳米载体 Lf-SPIONs,大鼠原位脑胶质瘤动物实验结果表明其对脑胶质瘤具有显著的靶向性,与注射前相比肿瘤部位磁共振成像 (MRI) 信号明显下降,最大改变为 74.8%,而注射未偶联 Lf 的 SPIONs,最大改变仅为 10.0%。此为我们为发展一种用于肿瘤诊断和治疗的多功能靶向纳米载药系统提供了基础。 相关研究结果已在 Biomaterials 32 (2011) 495-502上发表,审稿人对该项工作给予了较高评价 (Especially, in vivo application of the novel Lf-SPIONs contrast agent for the diagnosis of glioma with the high sensitivity and specificity is unique and scarce among other scientific works in this field)。已申请中国发明专利(申请号 200910273175.9)。 (2)纳米二氧化钛透皮行为与毒性机理 随着纳米科技的发展,纳米材料的生物安全性问题引起人们高度重视。纳米二氧化钛是一类重要的无机纳米材料,广泛应用于化妆品以及医药、化工、服装、环保、建材等领域。据报道,目前全世界每年用于化妆品的纳米二氧化钛已达数千吨。近年来,纳米二氧化钛的皮肤安全性问题引起国际相关领域学者的密切关注。 刘卫等以已在化妆品领域广泛应用的人造纳米材料纳米TiO2 为研究对象,建立和发展了纳米TiO2的透皮实验研究体系,首次活体研究了纳米TiO2在乳猪和BALB/C 裸鼠上的透皮行为,开创性地提出了长时间的皮肤暴露,未经修饰的纳米TiO2可穿越皮肤的角质层,产生器官蓄积并对皮肤及器官造成损伤这一重大研究结果,对于纳米TiO2的安全使用特别是化妆品的使用具有一定的警示作用和参考价值。在细胞层次上,系统研究了纳米TiO2光催化与细胞损伤的关系,首次从蛋白质硝化的角度,研究了纳米TiO2对皮肤的损伤作用,初步阐明了纳米TiO2对皮肤细胞损伤的机制。其中,纳米TiO2活体透皮实验研究结果已在国际毒理学核心期刊 Toxicology Letters(2009, 191(1): 1-8)发表。审稿人认为:“This is a very interesting paper with potentially very provocative results(这是一篇具有潜在颠覆性结果的非常有趣的论文)”。论文引起美国FDA临床药理部主任 Dennis Bashaw博士关注,并来函交流。截止2014年2月底,该论文网络累计他引已近150次。 (3)三维石墨烯与细胞生物学效应 三维石墨烯是张春在三蝶烯分子上三取代六苯并蔻合成的一类新型纳米材料。它具有独特的荧光性能,大共軛体系和超分子自组装性能。熊校勤和甘璐等选择肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系HL7702为研究对象,对三维石墨烯的生物效应进行了初步研究。结果表明:三维石墨烯纳米粒能选择性诱导肝癌细胞系HepG2细胞凋亡,而对正常肝细胞系HL7702的毒性较小,提示三维石墨在肝癌治疗中具有潜在价值。进一步研究证明了三维石墨烯纳米粒的细胞毒性是通过诱导细胞产生ROS所致。对两种细胞敏感性差异的原因,首先是:两种细胞对三维石墨烯纳米粒的内吞途径不同导致了摄取效率的差异。其次是由于HepG2细胞具有更高的基础氧化压力,进一步的氧化刺激很容易超过细胞的抗氧化阈值,导致细胞氧化平衡体系崩溃。 论文发表在:Biomaterials, 2012, 33(29):7233-7240、Organic Letters, 2012, 14(23): 5912-5915 (4)量子点在纳米药物动力学研究中的应用 针对纳米载药系统进入体内后复杂、特殊的体内过程,杨祥良提出用三个互相关联的“基元过程”来描述纳米药物经静脉注射后药物在体内的复杂的动力学行为:① 纳米载体本身在体内的离散分布,② 纳米载体的随机崩解与药物释放,③ 所释放的游离药物在体内的分布与消除。目前正在发展一种基于非线性数学和随机发展方程方法构建适合纳米载药系统体内过程的药动学数学模型。我们首先以纳米载药系统药动学研究方法为切入点,对纳米载体的量子点 (QDs) 标记方法、生物样本中游离药物与包裹药物等不同形式药物浓度的测定方法进行了探索。 纳米药物进入机体后,药物以纳米粒包裹、游离、蛋白结合等三种形式存在,传统的测定方法无法区分生物样品中纳米粒包裹和游离的药物,导致血药浓度、组织药物浓度与药效、毒副反应表现不一致。我们建立了生物样本中纳米粒包裹和游离的模型药物浓度的 HPLC 测定方法,并发现不同形式药物的药动学行为有明显差异。 这些研究结果已在 Small (2006, 2:999-1002)、Materials Letters (2006, 60:2565-2568、2007, 61: 1641-1644) 和 Journal of Biomedical Materials Research Part A 84A (2008) 1018-1025 上发表,受到同行的关注,累计他引 59 次,包括 ACS Nano (IF=7.493) 和Small (IF=6.171) 杂志论文。 第六部分: 团队中成长的学术带头人的优秀代表:黄开勋、杨祥良、张罗平 黄开勋,博士(1995年获华中理工大学生物医学工程专业博士学位) 博士生导师,国务院政府特殊津贴获得者,生物无机化学与药物湖北省重点实验室主任。1992-1993年在丹麦Roskilde大学生命科学与化学学院合作研究;2000年在意大利Padova大学生物化学系高级访问学者;2001 -2002年在英国Surrey大学生物医学与生命科学学院高级访问学者。曾任华中科技大学化学与化工系主任。主要社会兼职:国家食品药品监督管理局保健食品评审专家,教育部第四、五届科技委化学化工学部委员,中国化学会理事、湖北省化学化工学会副理事长,湖北省硒资源开发与利用促进会理事长,International Symposium on Selenium in Biology and Medicine(国际硒的生物医学研讨会)International Scientific and Program Organizing Committee成员,The International Journal of Molecular Sciences (ISSN 1422-0067) Editorial Board成员。主要研究方向:(1)硒蛋白的生物学功能,着重于硒蛋白在糖尿病、血管疾病和白内障发生发展中作用及机理;(2)新药制剂及功能食品的研究与开发;(3)无机纳米材料的合成与生物安全性研究。主持国家自然科学基金8项, 973项目子课题、863重大专项、新药研究基金、博士点基金各1项,湖北省、武汉市重点攻关项目多项。发表SCI论文110余篇,合作主编出版有硒的专著1本,参编专著3本。主持召开第一、第二届中韩双边硒的生物医学研讨会,作为副主席主持承办TEMA14(第14届人与动物微量元素国际学术研讨会)。 杨祥良,博士(1995年获华中理工大学生物医学工程专业博士学位),华中科技大学校特聘教授,博士生导师,教育部跨世纪优秀人才基金获得者。现任华中科技大学生命科学与技术学院常务副院长、国家纳米药物工程技术研究中心主任,世界中医药联合会新型制剂(中药)专业委员会副会长,生物无机化学与药物湖北省重点实验室副主任,全国生物物理学会自由基生物学医学专业委员会委员。主要从事纳米载药系统、纳米诊断与检测技术、先进给药技术等方面的研究及新药开发。为“纳米研究”重大科学研究计划项目“肝癌治疗的新型纳米药物研究”首席科学家。主持和承担的国家和省部级各类科研项目10余项,包括国家自然科学基金项目、“973”计划课题、国家重大科学研究计划课题、“863”计划课题、“十五”科技攻关课题、教育部和湖北省人才基金等。出版纳米药物相关专著3部,在ACS Nano, Advanced Functional Materials, Biomaterials, Small, Journal of Controlled Release等上发表SCI论文110余篇,他引1000余次。获得湖北省科技进步一等奖1项,二等奖1项,湖北省自然科学二等奖1项;获得授权中国发明专利26项。 张罗平是1983年入学于华中理工大学的第一个生物无机化学硕士研究生。她毕业后留校任教并获华中理工大学优秀教学奖,湖北省优秀论文奖(1986)。1987-1988年荣获第三世界科学院科研Fellowship先后在意大利Perugia及Padova大学做访问学者。她于1993年获加拿大Simon Fraser University生化毒理学专业博士学位。由于她的长期不懈努力,从博士后到助理研究员到科研副教授,于2012年她被正式聘请为美国加州伯克利大学(University of California, Berkeley)科研正教授。1990年以来,她在美国伯克利大学公共卫生学院,应用荧光原位杂交(FISH)技术及现代组学(Modern Omics)方法研究化学毒物-苯及甲醛对人体细胞基因毒性和暴露人群的血液毒性以及儿童白血病和其他类型的肿瘤。 二十多年来,她一直保持与中国科学家及教授们合作并坚持在国内做项目。她提出并创新了一些应用FISH的新方法从而被认为是FISH方法学的权威。她作为第一作者在Science期刊发表了2篇论文并在其他高优杂志上共发表论文130余篇。 第七部分 体会 1. 坚持硒、纳米药物的应用基础研究方向。 2. 不断深入和扩展相关研究内容,采用新研究方法。 3. 重视人才的培养。 由于学校重视,团队努力,三十年的发展,使我校生物我家化学处在全国先进行列,在世界上也占有一席之地。我们还要继续努力,不断攀登高峰。 ( 徐辉碧,化学与化工学院退休教授,原化学系系主任,原生命科学与技术学院院长。 黄开勋 杨祥良两位教授对本文撰写给予了很大帮助。本文经王夔院士、倪嘉缵院士审阅 )
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